動物細胞的冷凍保存

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  • 時間:2017/5/8 上午 11:44:00
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翻譯自:ATCC connection (2004) 24(2):10-11 翻譯者:陳欣怡/生資中心 助理技師 審譯者:黃效民/生資中心 資深研究員


大多數的細胞若無特別的要求,都可冷凍保存於-130°C 以下長達 多年。正確的冷凍保存步驟和方式要比投資於設備及試劑重要多了, 例如建立安全庫存(safety stock), 保存繼代數低的細胞,防止細胞 特性的改變,及提供和使用標準的試劑以供連貫性的實驗。

概觀:

當含細胞之懸浮液的溫度低於凝固點時,冰晶會開始形成而溶質 的濃度也相對的增加,如果細胞內的水分可以在降溫過程中滲透出 來,則細胞內的冰將會減少,緩慢的冷卻速度,大致是以每分鐘降 1 °C,可使細胞內的水分更容易在降溫過程中滲透出來;然而,細胞體 積會因流失水分而縮小,若縮到一定程度以下,則細胞會很快的失去 生存能力。添加冷凍保護劑如甘油或 DMSO 則可減緩此現象。

標準的冷凍保存細胞程序是將細胞置於加有冷凍保護劑的培養 基中,緩慢的冷凍細胞直到溫度低於-70°C。之後,再將冷凍管移至 液氮槽中以維持低於-130°C 的溫度。

解凍細胞則是非常簡單直接:將含細胞冷凍管由液氮槽中取出,立 刻在 37°C 的水浴槽中快速解凍,移入無菌操作台內直接加入生長培 養基稀釋培養或溫和的離心去除冷凍培養基,再種入加有完整生長培 養基的培養瓶中培養。

有很多的因素會影響解凍後細胞的存活率,不同的細胞株可能需 部分修改冷凍保存的步驟和方法以提高細胞解凍後的存活率。 某些 關鍵的要素可提供較佳的存活率,例如冷凍培養基的組成,細胞生長 期(growth phase),細胞週期(cell cycle)狀態以及冷凍培養基中的細胞 數和細胞濃度。

 

冷凍培養基

5至10的甘油或DMSO(dimethy sulphoxide)是最常用的冷凍保 護劑,雖然 DMSO 對細胞有毒性,但卻比甘油能更快穿透細胞且結 果的再現性較佳,然不幸的是,DMSO 會造成某些細胞的分化(如 HL-60,前骨髓母細胞),以及對一些細胞毒性太強(HBE4-E6/E7,肺 表皮細胞),此時以使用甘油較佳。甘油可以高溫滅菌,而 DMSO 則 必須以過濾方式除菌,在使用 DMSO 時要格外小心,因為它可快速 穿透接觸的皮膚,而將有毒物質也一起帶入體內。

特別需注意的是,必須使用試劑級( 或更高級,如細胞培養等級) 的 DMSO 或甘油,開瓶後需分裝儲存且避光。ATCC 有提供細胞培養等級的 DMSO (Cat#:4-X),而且是經過測試以確保其無毒性。對於 使用無血清培養的細胞,應添加 50的條件培養基 (conditioned medium,以無血清培養基培養細胞 24 小時後回收的培養液)到冷凍培 養基及解凍培養基,以增加細胞解凍後的存活。添加 10 到 20細胞 培養等級的牛血清蛋白(BSA, bovine serum albumin)至無血清冷凍培 養基也可提升冷凍後的存活。

其他的冷凍培養基配方,則包括了高濃度血清(如 90血清),以 提供額外的生長激素和冷凍保護作用,另外使用低溫設計配方的 balanced salt solution,或抑制細胞凋亡作用的添加劑可延緩解凍細胞 的死亡。對每一株特定的細胞最適合的配方,必須實際實驗測試。

 

設備

冷凍管

關於冷凍管的材質有兩種選擇:玻璃或塑膠。玻璃管較麻煩,需 要先滅菌才能使用,且無標籤,在封管時須使用火焰將管口熔融密 封,若不慎掉落容易破裂,也不易開管。然而,玻璃管能保存較久且 若密封完全可視為零故障的保存方式。ATCC 將細胞株的種子細胞保 存於玻璃管,而分讓細胞則保存於塑膠管。 塑膠管有兩種樣式:一種是內螺紋含矽膠墊圈,另一種則是外螺 紋的。剛開始市場上僅有內螺紋塑膠管,可是卻比外螺紋塑膠管擁有 一些不利的條件,舉例來說,矽膠墊圈雖提供了很好的封口,但蓋子 需要轉的剛剛好緊,太緊或太鬆都會滲漏。

 

可控速降溫機 Controlled-rate freezer chambers

有很多方法可達到一分鐘降 1°C 的降溫速率,其中最好的方式應 該是使用以電腦控制的可程式降溫機(e.g., CryoMed Freeze),ATCC 就是使用此方式。然而此設備並不便宜,但是對於某些敏感之細胞是 絕對必須的。也有較便宜的方式則是將冷凍管置於隔熱的盒子中,放 入-70°C(或低)的冰箱冷卻 24 小時,也有一些商品化冷卻產品可達到 接近降溫速率為一分鐘降 1°C 的理想(Mr. Frosty, Nalgene Catalog #5100-0001 StrataCooler, Stratagene Catalog # 400005)。另外,冷凍管 也可置於厚 15 公釐 (3/4 英吋),容量 1 公升的保麗龍盒子中,其中 再添加一些紙張、厚棉或保麗龍顆粒達到減緩降溫速度的目的

 

保存

長期保存於超低溫(低於-130°C)時,需使用特別的冰箱或液氮槽。 液氮槽的保存方式有兩種:一種是將冷凍管浸入液氮中,另一種則是 將冷凍管置於氣相層中液氮。浸入液氮中的方式可保有比較多的液 氮,因而需要較少的注意和充填維護,然而,當液氮進入沒封好的冷 凍管時,在取出時可能會發生氣爆(譯者註:易容易造成細胞污染), 基於這因素,ATCC 強烈的建議將冷凍管保存於液氮槽的氣相層中。 


保存

長期保存於超低溫(低於-130°C)時,需使用特別的冰箱或液氮槽。 液氮槽的保存方式有兩種:一種是將冷凍管浸入液氮中,另一種則是 將冷凍管置於氣相層中液氮。浸入液氮中的方式可保有比較多的液 氮,因而需要較少的注意和充填維護,然而,當液氮進入沒封好的冷 凍管時,在取出時可能會發生氣爆(譯者註:易容易造成細胞污染), 基於這因素,ATCC 強烈的建議將冷凍管保存於液氮槽的氣相層中。 

氣相層的系統中會在容器內產生溫度差的現象,液氮槽的最底層 會達-196°C,而上方的溫度則會依液氮的多寡及開桶的次數而不同, 為了確保安全的保存細胞,桶內一定要有足夠的液氮,這樣才能使上 方的溫度也能低於-130°C。所有的保存系統都應備有溫度警報器。

 

冷凍保存的程序

以下的程序適用於大多數的細胞培養,另可以依照細胞株不同的 需求而做改變。ATCC 細胞株的冷凍培養基配方提供於產品說明單 上,細胞進行冷凍保存前,應處於對數生長期,即生長旺盛且良好之 狀態

1. 在冷凍保存前先測試細胞是否有受到細菌、霉菌、黴漿菌及病毒 的感染。大多數的時候,測試結果將會在細胞冷凍後才得知,這時, 若確實有感染時,則將冷凍的細胞銷毀。

2. 準備好含有 5 DMSO 的冷凍培養基,切勿將 DMSO 直接加入細 胞液中,因 DMSO 加入液體中會釋放出大量熱能。

3.溫和的離心(10 min at 125x g) 將細胞上清液去除後,重新稀釋於冷 凍培養基,且維持每毫升活細胞濃度 1x106到 5x106 。另外維持部分 細胞繼續培養,直到解凍後的細胞存活率已確認(參照步驟 9)。

4. 標示細胞株的名稱及日期於冷凍管上,每管約加入 1 到 1.8 毫升的 細胞懸浮液(視冷凍管的大小而定)並封緊。

5. 室溫下,讓細胞在冷凍培養基中達到平衡,最少 15 分鐘但不得超 過 60 分鐘,通常就是分配細胞懸浮液至各冷凍管所花的時間,超過 60 分鐘,DMSO 可能會使細胞的活性降低。

6. 將冷凍管放入冷凍盒中,且將冷凍盒放進-70°C 的冰箱至少 24 小 時,另外也可使用可程式降溫機,將其設定在每分鐘降 1°C,直到溫 度低於-70°C 為止。

7. 迅速的將冷凍管移到液氮槽或-130°C 的冰箱,如果冷凍管待在-50° C 以上的環境下,冷凍物質將會以每分鐘上升 10°C 的速率溶解而對 細胞造成傷害。

8. 紀錄冷凍的位置及細節。

9. 等到細胞在-130°C 冰箱或液氮槽中超過 24 小時後,移出一管冷凍 管作培養,以測定細胞之存活率。


冷凍保存細胞的活化

冷凍管中細胞懸浮液的解凍活化必須越快越好,而且儘速加入完 整的培養基,即種入適當的培養瓶(flasks)。雖解凍的單層細胞也可活 化於多孔盤(multiwell plates),但結果並不比培養瓶來的好。 有些細胞株,像是解凍後的融合瘤細胞則需多培養幾天後才能完 全恢復,的確,有些融合瘤細胞在解凍後第一天看起來有死亡的現象 且會有很多細胞碎片。大多數細胞在解凍 24 小時內的存活率會下降 且達到最低點,會出現此現象,可能是冷凍保存過程中對細胞產生的 破壞而導致細胞凋亡作用。渡過這段時間,細胞則開始恢復,且以指 數方式增加。

1. 將冷凍管移出液氮槽且在 37°C 或在該細胞株正常生長溫度的水 浴槽中溫和的搖動,快速的解凍(大約 1~2 分鐘)。

2. 一旦管內物質溶解後,將冷凍管移出水浴槽且浸入或噴 70酒精 來消毒。接下來所有的步驟將在生物安全櫃中進行,在嚴格無菌 的狀態下操作。

3. 準備好培養瓶(例如 T-75 flask),並加入已預熱的 15 毫升的培養基。

4. 打開冷凍管的瓶蓋,將細胞懸浮液取出加入培養瓶內直接培養, 或溫和的離心(10 min at 125x g)以去除抗凍劑,將上清液移除後,重 新將細胞稀釋於 1 至 2 毫升的培養基中,再將此細胞懸浮液加入裝有 培養基的培養瓶中混合均勻。

5. 於 24 小時後觀察,而需要時做繼代培養。


sourcre from : BCRC生物資源保存及研究中心

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